免疫功能低下患者外周血白细胞中巨细胞病毒mRNA和编码即刻早基因DNA的检测

文摘:使用最近开发的体外生成pp65阳性多形核白细胞(PMNLs)的模型，我们证明了来自具有免疫能力的受试者的PMNLs可能同时含有传染性的人巨细胞病毒(HCMV)和病毒产物(pp65, p72, DNA，与感染临床HCMV分离物(VR6110)或其他野生型菌株的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)或人胚胎肺成纤维细胞(HELF)共培养60分钟后，即早期[IE]和pp67晚期mrna)。各病毒参数阳性的PMNLs数量随着共培养时间的增加而增加。使用实验室适应的HCMV毒株感染的HELF，在PMNLs中仅检测到非常少量的病毒DNA和IE和晚期mrna。一种细胞mRNA，即血管细胞粘附分子-1 mRNA，在感染和未感染的HUVEC中都大量存在，在与vr6110感染细胞共培养的PMNLs中检测到的数量比对照组大得多。在存在或不存在RNA、蛋白质和病毒DNA合成抑制剂的情况下，PMNLs与vr6110感染的受纳细胞共培养表明，共培养期间PMNLs中只转录IE基因。在PMNL中IE转录本的合成也得到了以下结果的支持:每个感染PMNL中只有IE mRNA的拷贝数(而不是DNA或pp67 mRNA)随时间显著增加，并且pp67与IE mRNA拷贝数之比从感染HUVEC中的大于10变为共培养PMNL中的小于1。荧光探针转移实验和电镜研究表明，感染病毒及其产物从感染细胞向PMNLs的转移可能仅由野生型菌株诱导的微融合事件介导。此外，HCMV pp65和p72通过双重免疫染色均显示定位于同一PMNLs的细胞核。两种不同的机制可以解释PMNLs中的病毒存在:(i)一个主要机制包括HUVEC或HELF和PMNLs的短暂微融合事件(仅由野生型菌株诱导)，并将活病毒和生物活性病毒物质转移到PMNLs; and (ii) one minor mechanism, i.e., endocytosis, occurs with both wild-type and laboratory strains and leads to the acquisition of very small amounts of viral nucleic acids. In conclusion, HCMV replicates abortively in PMNLs, and wild-type strains and their products (as well as cellular metabolites and fluorescent dyes) are transferred to PMNLs, thus providing evidence for a potential mechanism of HCMV dissemination in vivo.

文摘:研究肾移植受者外周血白细胞，比较以下人类巨细胞病毒(HCMV)感染标志物:间接免疫荧光检测pp65抗原，巢式聚合酶链反应(PCR)检测病毒DNA，逆转录后巢式PCR检测即早(IE)和晚期(pp150) mRNA。移植后对65例患者进行每周监测，持续20周。在20例HCMV DNA PCR阳性患者的76份样本中，检测出HCMV mRNA。IE和pp150 mRNA的检测量与pp65抗原阳性细胞的数量呈正相关，证实了pp65抗原作为病毒活跃复制的标记物的重要性。但在hcmv相关疾病的早期诊断和抗病毒治疗监测方面，病毒mRNA检测并不优于pp65抗原检测

文摘:通过核酸序列扩增(NASBA)对50例移植受者(包括26例固体器官移植受者(11例心脏和15例肺)和24例骨髓移植受者)的pp67 mRNA(晚期病毒转录本)进行定性检测，回顾性监测了人巨细胞病毒(HCMV)感染情况。将NASBA结果与HCMV病毒血症和抗原血症的前瞻性定量以及白细胞DNA(白细胞血症)的回顾性定量进行比较。其中29例NASBA阳性，10例NASBA阴性，11例HCMV阴性。NASBA在病毒血症定量前检测HCMV感染，而在白细胞、抗原血症定量后检测HCMV感染。在nasba阳性血液样本中，病毒血症、抗原血症和白细胞血症的中位水平明显高于nasba阴性hcmv阳性血液样本中检测到的相关水平。以白质血症定量为“金标准”，NASBA诊断HCMV感染的分析敏感性(47.3%)和阴性预测值(68.3%)介于抗原血症定量(72.3%)和病毒血症定量(28.7%)之间，特异性和阳性预测值较高(90 ~ 100%)。然而，对于本研究中HCMV感染再激活的SOTRs，启动优先治疗的临床相关抗原血症临界值≥100,NASBA的临床敏感性达到100%，特异性为68.9%。的起始antigenemia quantitation-guided治疗,实际值antigenemia水平是158(范围,124年至580年)在SOTRs激活感染了NASBA积极性提前3.5±2.6天,13.5(范围1到270)组,包括BMTRs和SOTRs原发感染(在他治疗开始后第一个确认血液中血巨细胞病毒检测)和世卫组织面对NASBA积极性2.0±5.1天后。经抗病毒治疗后，发现血浆中抗原血症和pp67 mRNA存在的时间相似。总之，监测HCMV pp67 mRNA的表达似乎是一种有前途的、标准化的工具，可用于确定是否需要开始和终止先发制人的治疗。 Its overall clinical impact should be analyzed in future prospective studies.

文摘:人巨细胞病毒(HCMV)疾病仍然是肺移植后发病和死亡的主要原因。目前，HCMV的常规诊断测试对于HCMV疾病是低效的、不敏感的或非特异性的。我们描述了一种高效、高灵敏度的定量聚合酶链反应(PCR)检测HCMV的方法，使用竞争PCR和荧光标记引物，我们使用该方法测量了6例肺移植受者在移植时和移植后2周临床稳定时供体和受体组织中的HCMV DNA载量。经支气管活检、支气管肺泡灌洗和外周血白细胞的总DNA产量足以进行分析，但支气管活检标本不能持续产生足够的DNA用于分析。HCMV DNA载量在不同组织间和不同组织内存在很大差异，与BAL或外周血细胞相比，肺组织中HCMV DNA载量倾向于更高。所有6例HCMV IgG血清阴性供体或受体均发现HCMV DNA存在。三名血清阴性匹配的移植受者中有一人发生了组织病理学证实的HCMV疾病，HCMV DNA水平在该时间点显示增加，随后在更昔洛韦治疗后下降。该试验将允许前瞻性研究来确认供体和受体组织中HCMV DNA负荷对HCMV疾病的预测价值。

文摘:本文描述了一种反转录巢式聚合酶链反应(PCR)方法，用于检测人巨细胞病毒(CMV)剪接晚期基因(SLG)的RNA，其产物(175 bp)很容易在琼脂糖凝胶中与目标为未剪接的病毒RNA或DNA (258 bp)的产物进行区分。将SLG-RT-PCR与3例患者骨髓移植后每周采集的黄外套标本中巨细胞病毒DNA的半定量PCR进行了比较，并与这些标本中巨细胞病毒的培养结果进行了比较，这两种方法都是基于检测细胞病变效应的常规病毒分离方法，以及通过病毒特异性单克隆抗体染色早期检测感染细胞的方法。SLG-RT-PCR对CMV RNA的检测与感染病毒的检测相关性较好，但仅当两种培养方法的结果相结合时，单独的培养方法都不如SLG-RT-PCR敏感。在循环中存在SLG RNA作为活跃CMV感染的标记是有价值的。

文摘:我们已经开发了一种简单、快速、可靠的方案，用于从人血清和尿液中小规模纯化DNA和RNA。该方法是基于朝性剂硫氰酸胍的溶解和核酸酶失活特性，以及在该剂存在下二氧化硅颗粒或硅藻的核酸结合特性。通过使用大小分馏的二氧化硅颗粒，核酸(共价闭合环状、松弛环状和线性双链DNA;单链DNA;和rRNA)可以在1小时内从12个不同的样品中纯化，并在初始反应容器中回收。纯化的DNA(虽然明显剪切)是限制性内切酶和DNA连接酶的良好底物，从picogram到microgram水平的高产量(通常超过50%)被回收。共纯化的rRNA几乎未降解。用大小分割的二氧化硅颗粒代替硅藻(单细胞藻类的石化细胞壁)，可以从富含细胞的来源中纯化出微克量的基因组DNA、质粒DNA和rRNA，例如致病性革兰氏阴性细菌。在本文中，我们展示了具有代表性的实验，说明了该程序的一些特点，可能在临床微生物学中有广泛的应用。

文摘:应用聚合酶链式反应(PCR)扩增技术检测新生儿组织培养和尿液标本中的巨细胞病毒(CMV)。利用合成的寡核苷酸引物对扩增CMV主要即早抗原基因和晚期抗原基因的DNA。通过凝胶电泳和寡核苷酸探针点杂交检测扩增产物。使用引物对和相关探针，我们发现46个不同的CMV组织培养分离物呈阳性;当同样的引物和探针被用于扩增其他疱疹家族病毒或人类基因组DNA时，没有检测到反应产物。44例先天性感染婴儿的尿液样本在用引物对和探针检测时呈阳性。与组织培养相比，凝胶电泳检测的敏感性为93%，特异性为100%，阳性结果的预测值为100%。点印迹分析的灵敏度提高到100%。我们认为PCR扩增可能是诊断先天性巨细胞病毒感染的有价值的工具。

文摘:一种市售的针对巨细胞病毒早期核蛋白的单克隆抗体在低速离心下用于从接种到MRC-5细胞的尿液标本中快速检测该病毒。接种的162份尿液标本中有19份(11.7%)通过免疫荧光和过氧化物酶抗过氧化物酶程序均呈阳性(敏感性为100%)，而在常规细胞培养中只有18份样品产生细胞病变效应(特异性为94.7%)。所有标本在感染后36小时通过免疫荧光和过氧化物酶抗过氧化物酶程序均呈阳性，而在细胞培养中平均需要9天才能产生细胞病变效应。

文摘:对52例肾移植受者在移植后3个月内巨细胞病毒(CMV)抗原阳性血白细胞(CMV抗原血症)的出现进行了研究。使用三种单克隆抗体的混合物，在取样后3-5小时内，在细胞离心血白细胞中检测CMV(即早期)抗原。结果与黄皮(巨细胞病毒血症)病毒分离、灵敏的酶联免疫吸附试验(ELISA)血清学和巨细胞病毒病的临床症状有关。所有14例巨细胞病毒血症患者抗原检测阳性，27例原发性或继发性巨细胞病毒感染患者中25例阳性，25例无活动性感染患者中2例阳性。在临床巨细胞病毒综合征患者中，巨细胞病毒抗原(CMV- ag)阳性血细胞的存在与体征和症状的周期相对应。在25例无活动性感染的患者中，23例未检测到巨细胞病毒抗原，在健康对照组和其他疱疹病毒感染患者中也未检测到巨细胞病毒抗原。CMV-Ag阳性血细胞平均出现在活动性感染的血清学体征前9天。该方法为CMV检测提供了一种快速而敏感的方法，能够进行早期临床诊断，随后逐渐减少免疫抑制或开始抗病毒治疗。

文摘:抗病毒治疗领域的进展现在发生得越来越频繁和迅速，经常在我们这些实践主要集中在抗菌药物治疗上的人中间产生不同程度的混乱。如何治疗感染人类免疫缺陷病毒的患者的巨细胞病毒感染构成了由这些进展所产生的困境的最好的例子之一，这个主题在这第一次艾滋病评论更新中进行了回顾。鉴于美国食品和药物管理局最近批准了膦甲酸酯，这一讨论非常及时;临床医生尤其有必要了解目前关于诱导治疗与维持治疗的思路，疗效的好处与药物相关毒性的不良反应，以及抗逆转录病毒药物与更昔洛韦或磷甲酸之间的相互作用。W. Lawrence Drew博士在该领域的职业生涯长期而富有成效，他是该领域的领先专家之一。在这次更新中，他解决了这些令人费解的问题。